Le provette che abbiamo siglato A+, A-, K+, K- vengono messe nel bagnetto termostatato a 70 °C per 15 minuti. Successivamente, con una provetta siglata LIG contenente la DNA ligasi, abbiamo inserito 8,0 μl di A+, 8,0 μl di K+, 6 μl di 5xB e infine 4 μl di acqua distillata.
Si centrifuga la provetta e si lascia a temperatura ambiente per un ora (37 °C), temperatura ideale per far lavorare la ligasi al meglio. Infine le A+ e K+ si mettono in freezer per interrompere le reazioni.